賽默飛熒光定量PCR儀（如QuantStudio系列）**時應注意的關鍵事項，涵蓋設備使用、實驗準備、數(shù)據(jù)分析、安全等方面：

一、實驗準備階段

1. 樣本與試劑準備

• 樣本應避免反復凍融，保持RNA/DNA質量。

• 所有試劑應解凍并混勻后再使用。

• 使用低吸附管或PCR專用耗材，減少吸附損失。

2. 反應體系設置

• 嚴格按照試劑說明書配制體系，注意引物、探針濃度。

• 使用去RNA酶/去DNA酶的無核酸水配制。

• 配置時操作應在冰上進行，避免酶活性變化。

3. 加樣操作

• 避免氣泡，影響熒光讀數(shù)。

• 封板前輕輕離心，確保液體在孔底。

• 使用光學封板膜，確保貼合緊密、無褶皺。

二、儀器操作階段

1. PCR板放置

• 保持板底清潔，避免灰塵、水漬影響檢測。

• 板放入儀器前注意方向正確，與軟件板圖一致。

2. 通道設定

• 選擇與試劑染料匹配的熒光通道。

• 若為多重檢測，確保熒光染料無通道重疊。

3. 擴增程序設置

• 根據(jù)反應體系設定溫度和循環(huán)參數(shù)。

• 通常熒光采集設在延伸階段。

4. 熔解曲線（如SYBR Green）

• 啟用熔解曲線分析可判斷擴增特異性。

• 單一峰形代表反應特異性良好。

三、數(shù)據(jù)分析階段

1. Ct值判斷

• Ct值過高（>35）應考慮模板濃度、污染或反應效率問題。

• 無模板對照應無擴增曲線，否則懷疑污染。

2. 擴增曲線觀察

• 正常擴增曲線呈“S"型。

• 曲線不規(guī)則或漂移可能因加樣誤差或設備問題。

3. 標準曲線分析（絕對定量）

• R2值應接近1，擴增效率在90–110%之間較理想。

四、安全與維護

1. 設備清潔

• 加熱模塊表面需定期擦拭。

• 避免液體流入樣本槽，若有泄漏立即處理。

2. 避免交叉污染

• 區(qū)分模板制備區(qū)與擴增區(qū)。

• 使用過濾吸頭，勤更換手套。

3. 試劑儲存

• 酶類試劑儲存于-20℃，避免頻繁凍融。

• 染料類避光保存，使用后立即蓋緊。

4. 數(shù)據(jù)備份

• 定期導出實驗數(shù)據(jù)，避免軟件崩潰造成丟失。

• 軟件升級前應先備份方法與結果文件。