賽默飛QS12k型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（Applied Biosystems QuantStudio 12K Flex Real-Time PCR System）是賽默飛公司推出的一款高通量、高靈敏度的實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀器，廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)、基因分型、突變檢測(cè)以及病原檢測(cè)等分子生物學(xué)研究領(lǐng)域。以下是關(guān)于如何使用該儀器的詳細(xì)步驟和注意事項(xiàng)。

1. 設(shè)備概述

QuantStudio 12K Flex PCR儀具備以下特點(diǎn)：

• 高通量支持：支持12,000個(gè)樣品的實(shí)時(shí)PCR分析，適用于大規(guī)模數(shù)據(jù)采集。

• 多通道熒光檢測(cè)：儀器支持最多6個(gè)熒光通道，可同時(shí)進(jìn)行多重PCR反應(yīng)，適用于多種熒光染料的檢測(cè)。

• 靈活的實(shí)驗(yàn)設(shè)置：支持多種實(shí)驗(yàn)格式，包括96孔板、384孔板，滿足不同實(shí)驗(yàn)需求。

• 高精度熱循環(huán)系統(tǒng)：精準(zhǔn)的溫控系統(tǒng)和均勻的溫度分布，確保PCR反應(yīng)的一致性和可靠性。

2. 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

2.1 安裝與檢查

在開始使用QuantStudio 12K Flex PCR儀之前，需要確保設(shè)備已正確安裝并連接好所有必需的外部設(shè)備，包括電源、計(jì)算機(jī)（如果使用外部軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析）、網(wǎng)絡(luò)連接等。

• 位置選擇：選擇一個(gè)穩(wěn)定的環(huán)境，避免設(shè)備受到電磁干擾、震動(dòng)和溫度波動(dòng)。

• 儀器檢查：打開設(shè)備電源后，進(jìn)行自檢，確保設(shè)備的硬件系統(tǒng)（如溫控系統(tǒng)、熒光檢測(cè)系統(tǒng)等）運(yùn)行正常。

2.2 樣品和試劑準(zhǔn)備

• DNA模板：根據(jù)實(shí)驗(yàn)的目的準(zhǔn)備DNA模板。確保模板的純度和濃度適合定量PCR實(shí)驗(yàn)。

• 引物和探針：根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需求，設(shè)計(jì)和準(zhǔn)備適合的引物和探針?？梢允褂肨aqMan探針或者SYBR Green染料等。

• PCR反應(yīng)體系：通常包括DNA模板、引物、探針、熒光染料、PCR緩沖液、dNTPs、DNA聚合酶等。

配制PCR反應(yīng)液時(shí)，應(yīng)根據(jù)所使用的試劑盒的說(shuō)明書或具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，確保反應(yīng)體系的準(zhǔn)確性。

2.3 樣品加載

將PCR反應(yīng)混合物和模板加載到PCR板中，通常使用96孔板或384孔板。加載樣品時(shí)，應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡，確保每個(gè)孔中反應(yīng)液的體積一致。

3. 設(shè)置實(shí)驗(yàn)程序

3.1 創(chuàng)建新實(shí)驗(yàn)

打開QuantStudio 12K Flex PCR儀的觸摸屏界面或通過計(jì)算機(jī)進(jìn)行操作，選擇“新建實(shí)驗(yàn)"并進(jìn)入實(shí)驗(yàn)設(shè)置界面。

• 選擇反應(yīng)板類型：選擇96孔板、384孔板或其他適合實(shí)驗(yàn)需求的板型。

• 選擇熒光染料/探針：根據(jù)所使用的實(shí)驗(yàn)體系，選擇適合的熒光通道和染料類型（如SYBR Green、TaqMan探針等）。QS12K支持最多6個(gè)熒光通道，因此可以進(jìn)行多重PCR實(shí)驗(yàn)。

3.2 設(shè)置熱循環(huán)程序

• 熱啟動(dòng)：根據(jù)所用的DNA聚合酶和試劑的要求，設(shè)置熱啟動(dòng)步驟。通常在反應(yīng)的初期進(jìn)行熱啟動(dòng)，以確保DNA聚合酶激活并減少非特異性擴(kuò)增。

• 擴(kuò)增程序：設(shè)置合適的PCR擴(kuò)增循環(huán)程序，通常包括：

• 變性步驟：通常在95°C下進(jìn)行約15秒，目的是分開DNA雙鏈。

• 退火步驟：根據(jù)引物的退火溫度（Tm值）設(shè)置退火溫度，通常在55-65°C范圍內(nèi)，持續(xù)20-30秒。

• 延伸步驟：在72°C下進(jìn)行，通常每個(gè)循環(huán)延伸時(shí)間為30秒到1分鐘，具體時(shí)間取決于擴(kuò)增片段的大小。

3.3 數(shù)據(jù)采集

在每個(gè)擴(kuò)增循環(huán)的延伸階段或退火階段結(jié)束時(shí)進(jìn)行熒光數(shù)據(jù)采集。設(shè)置合適的熒光檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)，確保信號(hào)的準(zhǔn)確捕捉。

3.4 啟動(dòng)實(shí)驗(yàn)

完成所有設(shè)置后，確認(rèn)無(wú)誤后點(diǎn)擊“開始實(shí)驗(yàn)"按鈕，啟動(dòng)實(shí)時(shí)PCR實(shí)驗(yàn)。

4. 實(shí)驗(yàn)過程中監(jiān)測(cè)

在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行過程中，QuantStudio 12K Flex PCR儀會(huì)實(shí)時(shí)顯示PCR擴(kuò)增曲線、熒光信號(hào)強(qiáng)度變化等數(shù)據(jù)。用戶可以通過設(shè)備的顯示界面實(shí)時(shí)監(jiān)控實(shí)驗(yàn)進(jìn)度。

• 擴(kuò)增曲線：隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，熒光信號(hào)會(huì)逐漸增強(qiáng)，用戶可以看到擴(kuò)增曲線的變化。在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間點(diǎn)，熒光信號(hào)超過背景信號(hào)時(shí)，稱為“閾值周期"（Ct值）。Ct值的大小與初始模板的數(shù)量成反比。

• 反應(yīng)板監(jiān)控：如果使用多孔板，可以查看每個(gè)孔的實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線，方便了解每個(gè)樣品的反應(yīng)情況。

5. 數(shù)據(jù)分析與結(jié)果

5.1 Ct值的確定

通過實(shí)時(shí)熒光信號(hào)的監(jiān)測(cè)，可以獲得每個(gè)樣品的Ct值。Ct值代表熒光信號(hào)達(dá)到閾值時(shí)的循環(huán)數(shù)，是反應(yīng)效率的一個(gè)重要指標(biāo)。

• 低Ct值表示樣品中目標(biāo)DNA的初始量較高。

• 高Ct值表示樣品中目標(biāo)DNA的初始量較低。

5.2 數(shù)據(jù)導(dǎo)出與分析

完成實(shí)驗(yàn)后，用戶可以通過設(shè)備的分析軟件導(dǎo)出數(shù)據(jù)并生成實(shí)驗(yàn)報(bào)告。QuantStudio 12K Flex PCR儀支持多種數(shù)據(jù)分析功能，如：

• 標(biāo)準(zhǔn)曲線分析：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的Ct值與已知濃度構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中目標(biāo)基因的拷貝數(shù)。

• 相對(duì)定量分析：使用2-ΔΔCt方法進(jìn)行相對(duì)定量分析，比較不同樣本間目標(biāo)基因的表達(dá)量。

• 多重PCR分析：如果進(jìn)行多重PCR實(shí)驗(yàn)，可以同時(shí)分析多個(gè)目標(biāo)基因的表達(dá)或檢測(cè)多個(gè)突變。

5.3 報(bào)告生成

分析完畢后，用戶可以生成實(shí)驗(yàn)報(bào)告，報(bào)告包括各個(gè)樣品的Ct值、擴(kuò)增曲線、標(biāo)準(zhǔn)曲線、相對(duì)定量數(shù)據(jù)等內(nèi)容。

6. 注意事項(xiàng)與故障排除

6.1 常見問題

• 擴(kuò)增失敗或Ct值異常高：可能由于模板DNA濃度過低、引物設(shè)計(jì)不當(dāng)、PCR反應(yīng)體系問題等導(dǎo)致。檢查樣品質(zhì)量和反應(yīng)體系，必要時(shí)優(yōu)化引物設(shè)計(jì)。

• 非特異性擴(kuò)增：出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增可能是由于引物退火溫度設(shè)置不合適?？梢酝ㄟ^提高退火溫度來(lái)提高特異性。

• 熒光信號(hào)不穩(wěn)定：檢查熒光染料的濃度是否合適，避免反應(yīng)液中有氣泡，氣泡可能導(dǎo)致信號(hào)的偏差。

6.2 清潔與維護(hù)

定期清潔PCR儀器，保持熒光檢測(cè)窗口的清潔，避免灰塵或污染影響熒光信號(hào)的準(zhǔn)確性。

7. 總結(jié)

QuantStudio 12K Flex實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀具有高度的靈活性和高通量能力，適合多種分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的需求。通過合適的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、反應(yīng)體系優(yōu)化和數(shù)據(jù)分析，能夠獲得準(zhǔn)確、可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在使用時(shí)，確保設(shè)備、試劑、樣品和程序設(shè)置的正確性，以獲得實(shí)驗(yàn)效果。